如何选择聚类参数

[zhendejuzi]

您好。请问假设序列的两端是保守的，中间比较长的序列是不保守的。进行不同序列的cluster的会有影响吗？感觉很难设计出primer

[joybio]

@zhendejuzi 通常情况下很难聚类，而且引物设计时考虑的因素很多（二聚体，GC等等），有的时候仅仅序列保守无法设计出可用引物。

[zhendejuzi]

1）我保留序列两端的保守位置，然后将中间替换成‘ 'G' *200’，例如：保守序列1+‘GGGGGGGG...GGGGGGGGGG’+保守序列2。然后在让PRODUCT_size>200，使得会设计在两端。感觉有时候可以强行抵消中间序列不保守对cluster的影响。
2）但是，有时候聚类会得到很多很小的类，seq_num<5，代码中有没有参数将能对这种小类进行操作跳过，否则太花时间了。
3）我将dege_number和degeneracy，entropy阈值进行放松（例如：6,16,5），但是在得到的结果中，dege_number通常也不会大于4。在进行进一步的过滤后到/Clusters_cprime，就没有primer了，然后就报错了。话说：a) 有没有办法产生更加宽松的阈值。b)产生多对（例如n=3）的primer的将coverage合并上去，毕竟不同位置的碱基差异可能有连锁不平衡。

[joybio]

@zhendejuzi 非常感谢您的反馈，问题很详细很专业。
1）操作没问题，可以这样操作。
2）目前没有调控小类的参数，可以把中间的G缩短，序列长度越长比对越慢，无关中间序列是什么。
3)multiPrime内部有一个degeneracy的上限，不会无限制增加简并度，上限取决于参数综合设计，最后会定在32-128。
a)放宽阈值的参数有很多，可以在yaml里尝试修改。b)这个想法很好，而且我也想过去实现它，但是最后想法流产了，因为一个cluster多对引物的话会导致产物复杂，经常会因为多对引物针对一个cluster而产生多个PCR产物，如果PCR产物有交集就会倾向于扩增更短的产物。不过在Cluster_primer和Cluster_cprimer中应该有每个cluster的候选引物，因为限制条件过多而无法入选的引物都在这其中。考虑到计算上的阈值可能和实际上有区别，我们曾经的经验是在这些里面选择引物增加引物池覆盖度。

[zhendejuzi]

目前看来，
聚类阈值严格一点的话，会有很多小类，导致后续分析时间非常长。
聚类阈值放松一点的话，有些类别难以得到Cluster_cprimer，报错